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大肠杆菌转化实验

发布时间:2016-06-27  来源:杭州以恒生物科技有限公司  点击:0 次

大肠杆菌转化实验

大肠杆菌转化可以:(1)将重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制,增殖和表达,以获得目的基因;(2)验证大肠杆菌感受态细胞效果;(3)用于分子生物学其他研究。

热击法

实验方法原理

质粒DNA或重组DNA粘附在细菌细胞表面,经过42°C短时间的热击处理,促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代,待质粒上所带的抗菌素基因表达,就可以在含抗菌素的培养基中生长。

实验材料

质粒DNA重组DNA

试剂、试剂盒

LB培养基蒸馏水IPTGX-gal氨苄青霉素

仪器、耗材

旋涡混合器微量移液取样器移液器吸头离心管双面微量离心管架干式恒温气浴恒温水浴锅制冰机恒温摇床培养皿超净工作台酒精灯玻璃涂棒恒温培养箱

实验步骤

一、实验材料准备

1.  器材

 

旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,1.5 ml 微量离心管,双面微量离心管架,干式恒温气浴(或恒温水浴锅),制冰机,恒温摇床,培养皿(已铺好固体LB-Amp),超净工作台,酒精灯,玻璃涂棒,恒温培养箱。

 

2.  试剂

 

培养基(不加抗菌素),LB培养基(加抗菌素),无菌ddH2O,IPTG,X-gal。

 

3.  材料处理

无菌ddH2O,1.5 ml 离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌),20%IPTG(M/V),2% X-gal(M/V,用N,N-二甲基甲酰胺配)。

 

二、操作步骤

 

1.  事先将恒温水浴的温度调到42℃。

 

2.  从-70℃ 超低温冰柜中取出一管(100 μl)感受态菌,立即用手指加温融化后插入冰上,冰浴5~10 min。

 

3.   加入5 μl 连接好的质粒混合液(DNA含量不超过100 ng),轻轻震荡后放置冰上20 min。

 

4.  轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2 min进行热休克,然后迅速放回冰中,静置3~5 min。

 

5.  在超净工作台中向上述各管中分别加入500 μl LB培养基(不含抗菌素)轻轻混匀,然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1 h。

 

6.  在超净工作台中取上述转化混合液100-300 μl,分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。

 

7.  如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话,滴完菌液后再在平板上滴加40 μl 2% X-gal,8 μl 20% IPTG,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
 

8.  在涂好的培养皿上做上标记,先放置在37℃恒温培养箱中30~60 min 直到表面的液体都渗透到培养基里后,再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。

 

9.  在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇,擦干桌面,写实验报告。

 

10.  观察平板上长出的菌落克隆,以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。

收起 

注意事项

1.  玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻,待其冷却后再涂。

CaCl2转化法

实验材料

大肠杆菌

试剂、试剂盒

CaCl2氨苄青霉素LB

仪器、耗材

离心机分光光度计摇床

实验步骤

1.  接种—个单菌落于50 ml LB培养液中,于37℃摇床培养过夜(250 r/min)。

2.  往一个2 L 的烧瓶中加入400 ml LB培养液,再加入4  ml 过夜培养液,于37℃;摇床,培养至OD590为0.375。


3.  将培养液分装到8个50 ml 预冷无菌的聚丙烯管中,于冰上放置5~10 min,然后于4℃,1 600 g 离心7 min。

 

4.  细胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl2“溶液重悬,于4℃,以1 100 g 离心5 min 。

5.  细胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl2溶液重悬,冰上放置30 min,于4℃,1 100 g 离心5 min。

 

6.  用2 ml  冰冷的CaCl2溶液重悬各管细胞,然后按每管250 μl 的量分装于预冷的无菌聚丙烯管中,立即冻存于- 70℃。

7.  按照以下各步骤用10 ng pBR322转化100 μl 感受态细菌。

8.  将合适体积的转化物涂于含有氨苄青霉素的LB平板上,37℃培养过夜。


9.  将10 ng 加入到一个15 ml 无菌的圆底试管中,并放置冰上。

10.  将盛有感受态细胞菌的管子握在手上使菌液迅速熔化。

11.  立即将100 μl 感受态细菌加 入到管中,轻轻旋动,并放置冰上10 min 。

12.  将管故入42℃水浴2 min 进行热休克,然后加入1 ml LB 培养液于每一支试管中。

13.  于37℃置滚筒式摇床口培养1 h。

14.  将几个稀释度菌液涂布于含合适抗生素的平板上,于37℃培养12~16 h

一步法

实验材料

大肠杆菌

试剂、试剂盒

TSS葡萄糖LB

仪器、耗材

离心机分光光度计摇床

实验步骤

1.  按1:100的比例将过夜培养的菌液如人到新鲜的LB培养液中,于37℃培养至为OD600为0.3~0.4。

 

2.  加入等体积的2×TSS于菌液中,在冰上温和地混匀。

 

3.  将100 μl 感受恣细菌和1~5 μl DNA加入到一个冰冷的聚丙烯管或玻璃管中,4℃放置5~60 min。

4.  加入0.9 ml 含20 mmol/l 萄糖的LB培养液,37℃温和振荡培养30~60 min 在合适的平扳上挑选转化体。

高效率电转化法

实验材料

大肠杆菌

试剂、试剂盒

LBSOC

仪器、耗材

电转化仪离心机分光光度计

实验步骤

1.  接种一个单菌落于5 ml LB培养液,37℃温和振摇培养5 h 或过夜。

2.   将2.5 ml 培养物加人到盛有500 ml LB培养液的2 L 烧瓶中,37℃摇匀振荡培养至OD600为0.5~0.6。

 

3.  细菌在冰水浴冷却10~15 min,然后转移到预冷的1升离心瓶中。于2℃,5 000 g 离心20 min 沉淀用5 ml 预冷的水溶解6。

4.  加入500 ml 冰冷的水,混匀,按步骤3重复离心1次,立即将上清倒掉,用残余的液体重悬细胞。

 

5.  新鲜制得的细菌

(1)将悬浮液加入到预冷的50 ml 聚丙烯管中,2℃,5 000 g 离心10 min。

(2)估计细胞沉淀的体积,沉淀用等体积的冰冷水重悬。

(3)按50~300 μl 分装于预冷的微量离心管中。

6.  冻存细菌

(1)加入40 ml 冰冷的10%甘油,混合,然后按照步骤5离心。

(2)估计沉淀的体积,然后加入等体积的冰冷的10%甘油,重悬菌体。

(3)按50~300 μl 分装于预冷的微量离心管中。

(4)于干冰上冷冻并贮存于-80℃。

7.  将电转化仪调到2.5 kV、 25 μF ,脉冲控制器调到200~400Ω。

8.  将1 μl 质粒DNA加入到盛有新鲜制备的细菌或融化的冻存细菌的小管中,混匀。

 

9.  将转化混合物转移到预冷的电转化池中,吸干池的外表面,然后放入样品槽中。
 

10.  进行脉冲电转化,然后取出电转化池,马上加入1 ml SOC培养液,并且用巴斯德吸管转移到无菌的培养管中。

11.  于37℃,中速振荡培养30~60 min。

12.  分小份涂布于含有抗生素的LB平板上。

 

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