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石蜡切片免疫组化实验

发布时间:2016-06-27  来源:杭州以恒生物科技有限公司  点击:0 次

石蜡切片免疫组化实验

免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂  (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原 (多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究。根据标记物的不同分为:免疫酶法、免疫荧光法、亲和组织化学法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。其中前三种最常用。

即用型(Envision)快速酶免疫组化二步法

 

 

方法原理

根据聚合酶技术把辣根过氧化物酶抗鼠或/和抗兔IgG分子结合在多聚酶上形成多聚物分子,其与待检的抗原特异性的结合后,加入底物显色。

实验材料

石蜡切

试剂、试剂盒

PBS柠檬酸盐缓冲液蒸馏水增强剂酶标抗鼠 兔聚合物苏木素酒精二甲苯树胶盐酸二氨基联苯胺

仪器、耗材

烘箱微波盒塑料切片架显微镜胶头滴管

实验步骤

1.  石蜡切片置于67℃烘箱中,烘片2小时,脱蜡至水,用pH7.4的PBS冲洗三次,每次3分钟(3×3’)。

 

2.  取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液,加入微波盒中,微波加热至沸腾,将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上,放入已沸腾的缓冲液中,中档微波处理10分钟,取出微波盒流水自然泠却,从缓冲液中取出玻片,先用蒸馏水冲洗两次,之后用PBS冲洗2×3’。(注:不是所有的抗体都需要微波修复的,视具体情况而定)

 

3.  每张切片加1滴3%H2O2,室温下孵育10分钟,以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3×3’。

 

4.  除去PBS液,每张切片加1滴相应的第一抗体(相应稀释倍数),室温下孵育2小时。

 

5.  PBS冲洗3×5’。除去PBS液,每张切片加1滴聚合物增强剂,室温下孵育20分钟。PBS冲洗3×3’。

 

6.  除去PBS液,每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物,室温下孵育30分钟。PBS冲洗3×5’。

 

7.  除去PBS液,每张切片加1滴新鲜配制的DAB液(二氨基联苯胺),显微镜下观察5分钟。

 

8.  苏木素复染,0.1%HCl分化,自来水冲洗,蓝化,切片经梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封固,晾干后观察。

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其他

一、特点

1.  在切片加上一抗后,第二抗体标记多聚螯合物酶(HRP)的复合物与一抗结合,在多聚螯合物上有大量的HRP分子,使抗原信号有显著的放大,其敏感性较SABC、SP法高。

2.  由于多聚物在体内不存在,又不使用生物素,从而避免了由于生物素引起的非特异性背景染色,背景比SABC、SP法清晰。

3.  辣根过氧化物酶与二抗结合在多聚物上,替代传统方法的 二抗、三抗,减少了实验步骤,且试剂孵育时间短,只需15分钟,使得免疫组化方法更简单,实验时间比SABC、SP法大为缩短。

 

链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶连接sp法

实验方法原理

SP(streptavidin-perosidase)法,即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法。SP法是最常使用的方法。

试剂、试剂盒

二甲苯酒精PBS双氧水枸橼酸缓冲液羊血清工作液辣根过氧化物酶链霉素卵白素苏木素DAB

仪器、耗材

冰箱显微镜烧杯玻璃缸

实验步骤

1.  烤片:68℃,20 min。

 

2.  常规二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水:二甲苯I 20 min⇒二甲苯II 20 min⇒00%酒精10 min⇒100%酒精10 min⇒95%酒精5 min⇒80%酒精5 min⇒70%酒精5 min。

 

3.  阻断灭活内源性过氧化物酶:3%H2O2 37℃孵育10 min,PBS冲洗3X5 min。

 

4.  抗原修复:置0.01 M枸橼酸缓冲液(PH6.0)中用煮沸(95℃,15-20 min),自然冷却20 min以上,再用冷水冲洗缸子,加快冷却至室温,PBS冲洗3X5 min。

 

5.  正常羊血清工作液封闭,37℃10 min,倾去勿洗。

 

6.  滴加一抗4℃冰箱孵育过夜,PBS冲洗3X5 min(用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照);滴加生物素标记二抗,37℃孵育30 min,PBS冲洗3X5 min。

 

7.  滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液,37℃孵育30 min,PBS冲洗3X5 min。

 

8.  DAB/H2O2反应染色,自来水充分冲洗后,苏木素复染,常规脱水,透明,干燥,封片。

卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法

实验材料

蜡块切片

试剂、试剂盒

多聚甲醛蒸馏水蔗糖过氧化氢甲醇PBS酒精KPBS牛血清白蛋白叠氮纳一抗二抗

仪器、耗材

冰箱显微镜烧杯

实验步骤

1.  4%多聚甲醛常规灌注固定,取材并置20%蔗糖溶液(4℃)中过夜。蜡块制作。切片,贴片。0.01 M KPBS清洗5 min×3后;

 

2.  加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液(甲醇80 ml+0.01 M KPBS 100 ml+30%过氧化氢)30 min,以消除内源性过氧化物酶的影响,0.01 M  PBS清洗5 min×3;

 

3.  加入配好的0.3% Triton X100(30% Triton X100+0.01 M  KPBS 100 ml)30 min,以增加细胞的通透性,0.01 M KPBS清洗5 min×3;

 

4.  加入用血清稀释液(牛血清白蛋白1.00 g+0.01 M PBS 100 ml+叠氮纳0.08 g)稀释的一抗,4℃存放24-48 h;吸去抗体,0.01 M KPBS洗5 min×3;

 

5.  加入0.01 M KPBS稀释的的二抗,室温孵育2 h。0.01 M KPBS洗5 min×3;

 

6.  加入ABC复合物之类的抗体,室温孵育2 h,0.01 M KPBS洗5 min×3;蒸馏水迅速冲三次;

 

7.  加入显色液,进行免疫组织化学显色,时间一般不超过30 min,可不时在显微镜下进行观察,待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液,用蒸馏水迅速冲三次后加入0.01 M KPBS终止反应;

 

8.  梯度酒精脱水之后,封片,拍照。

链霉亲和素-生物素-过氧化物酶符合物(SABC)法

实验方法原理

SABC(Strept Avidin-Biotin Complex)法是一种显示组织和细胞中抗原分布的简便而敏感的免疫组化染色方法,是众多免疫组织化学方法的一种。SABC法:一抗+ 生物素标记二抗+ 滴加试剂SABC(链霉卵白素+ 辣根酶标记生物素)+ 辣根酶底物显色。目前常用的亲和素从链霉菌(streptomyces)培养物中提取,因此称为链霉亲和素—生物素—过氧化物酶复合物技术(streptavidin biotin-peroxidase complex method,SABC法)。

 

生物素(biotin)为含硫的杂环单羧酸,分子量小,通过其羧基与蛋白质的氨基结合,从而可标记抗体和酶。亲和素(avidin)又称抗生物素蛋白,是一种糖蛋白,在鸡蛋白中被发现,分子量为68 000。生物素与亲和素有很高的亲和力,1个亲和素分子上有4个生物素结合位点。在ABC法中,不对特异性第一抗体进行标记,而用生物素标记第二抗体,染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合,制成ABC合物,并使亲和素分子上至少空出1个生物素结合位点。染色时,标本中的抗原先与第一抗体结合,后者再与生物素标记的第二抗体结合,然后加入ABC复合物,结合到第二抗体的生物素上,最终形成的复合物网络了大量的酶分子。因此,敏感性更高。

实验步骤

一、洗载玻片

 

1.  将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中,目的是为了是载玻片上的硅胶等除去,同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整,便于组织吸附。

2.  置于清水中清洗,除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4(大约冲一个小时左右)。

3.  将载玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37℃温箱中,将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面,由于Lys带正电,而大多数的组织带负电荷,从而产生吸附作用。

 

二、包埋组织

 

1.  在铁模具中加入一些液态石蜡,先稍微冷却,然后再将待包埋的组织置于石蜡之中,并排列整齐。

2.  将塑料模具盒盖上,最后加入少许液体石蜡,进行冷冻,使石蜡变成固态。

 

三、切片

 

1.  将包埋好的组织从模具上取下来,并置于石蜡切片机上,切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致。

2.  调节切片的厚度,一般为5 um,如果比较难切,则可以适当调整厚度,用毛笔将切割的载玻片向外拉,并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40 ℃温水中。

 

四、捞组织

 

当组织载玻片置于40 ℃温水中之前,要先将水浴中的气泡赶走,以免气泡受热上浮而贴到组织上,组织受热展开,最好是组织不起皱纹,用载玻片捞组织时,一般取载玻片的下1/3或者下1/2一般每种组织捞5-6张,其中2-3张是备用的,每张载玻片上通常捞两份组织,做对照使用,这样形成的误差就比较小了,而且捞载玻片的时候最好方向一致,以便观察,再将捞出来的载玻片置于架子上,放入37 ℃温箱中烘干。

 

五、脱蜡

 

依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精,起脱蜡作用的主要是二甲苯,依据的是相似相溶的原理。一般在每个试剂中放10 min,天气热可以少放几分钟,相反,天气较冷的话就要适当延长脱蜡时间,一般为12-15 min。

 

六、抗原修复

 

脱蜡后在清水中冲洗一段时间,加入3%H2O2浸泡10 min,从而除去内源性的过氧化氢酶,然后倒掉H2O2,在清水中洗两次,再加入柠檬酸缓冲液,放入微波炉中蒸煮3 min(中火),一般刚到沸腾即可,冷却至室温,然后再蒸煮一次,冷却至室温,蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。

 

七、血清封闭

 

冷却至室温后,将柠檬酸缓冲液倒掉,水洗2次,并将载玻片置于PBS中5 min,洗2次,擦干组织周围的PBS液,马上加上血清,使一些非特异性的位点封闭起来,然后放入37 ℃温箱中半小时。血清稀释10倍(900 ul PBS:100 ul血清封闭液)。

八、加一抗

 

将温箱中的载玻片取出,用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清,加一抗,如果做对照实验,就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4℃冰箱中保存过夜。

 

 

九、加二抗

 

将载玻片从冰箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5min,擦干组织周围的PBS后加上二抗,然后置于37℃温箱中半小时。

 

十、加SABC

 

将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干组织周围的PBS后加上SABC, 然后置于37℃温箱中半小时。SABC稀释100倍(990ul PBS:10ul SABC)。

 

 

十一、加显色剂

 

将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干组织周围的PBS后加上显色剂。(显色剂的配置:在1ml水中加1滴显色剂A,摇匀,然后加1滴显色剂B,摇匀,再加1滴显色剂C,摇匀)   A:DAB   B:H2O2   C:磷酸缓冲液

 

十二、复染

 

将显色后的片子用清水冲洗一段时间后,浸泡于苏木精中染色,一般动物组织为半分钟,植物组织3-5min。

 

十三、脱水

 

将复染后的片子置于水中冲洗后,依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min,最后浸泡在二甲苯中,搬到通风柜中。

 

十四、封片

 

用中性树胶滴在组织旁边,再用盖玻片盖上,要先放平一侧,然后轻轻放下另一侧,以免产生气泡,封好片子后置于通风柜中晾干。

 

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