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质粒DNA提取实验

发布时间:2016-06-27  来源:杭州以恒生物科技有限公司  点击:0 次

质粒DNA提取可以:(1)快速纯化质粒;(2)用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。

碱解法

实验方法原理

质粒多为一些双链、环状的DNA分子,是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作,进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。
 

提取质粒的基本步骤分为三步:

①细菌的培养和质粒的扩增

②细菌菌体的裂解

③质粒DNA的纯化

实验材料

大肠杆菌

试剂、试剂盒

Tris-HclEDTA葡萄糖NaOHKAacNaAc异丙醇溶菌酶酚:氯仿无水乙醇LB培养基

仪器、耗材

超净工作台培养箱摇床恒温水浴锅台式离心机取液器低温冰箱冷冻真空干燥机电泳仪水平电泳槽紫外观测仪

实验步骤

一、材料与试剂准备
 

1.  材料:大肠杆菌。
 

2.  仪器:超净工作台,培养箱,摇床,恒温水浴锅,台式离心机,取液器一套,低温冰箱,冷冻真空干燥机,电泳仪,水平电泳槽,紫外观测仪。
 

3.  试剂:
 

(1)Solution I :25 mM Tris-Hcl(pH7.4),10 mM EDTA(pH8.0),50 mM葡萄糖,高压灭菌,4℃保存。

(2)Solution II :0.2 M NaOH, 1%SDS 现配现用。

(3)Solution III :5 N KAc pH4.8,高压灭菌,4℃保存。

(4)3 M NaAc pH5.2,高压灭菌,4℃保存。
(5)异丙醇,溶菌酶(8 mg/ml),酚/氯仿,无水乙醇,70%乙醇,LB培养基,电泳试剂。
 

二、操作步骤
 

1.  细菌繁殖:LB培养基,2 ml/20 ml,37℃,200 rpm,摇一摇,过夜。
 

2.  离心10 min,5 000 rpm, 4℃;弃上淸液。
 

3.  沉淀(菌体细胞)预冷的TES缓冲液洗涤,离心10 min,5 000 rpm, 4℃,加入预冷的1 ml Solution I,冰浴10 min。
 

4.  重新悬浮,加入150 ul溶菌酶母液,室温放置5 min。
 

5.  加入1.2 ml Solution II, 冰浴5 min。
 

6.  加入0.9 ml预冷乙酸钾,混匀,离心10 min,12 000 rpm,4℃。
 

7.  加入1.5 ml异丙醇,-20℃冰箱内放置15 min。
 

8.  离心10 min,12 000 rpm,4℃。
 

9.  取沉淀,悬于400 ul TE缓冲液中。
 

10.  加入40 ul,3 M NaAc。
 

11.  酚/氯仿,抽提,乙醇沉淀。
 

12.  离心10 min,12 000 rpm,4℃。
 

13.  取沉淀,冷冻干燥,再悬浮于50 ul TE缓冲液中。
 

14.  电泳检测提取DNA的质量。

SDS碱裂解法(试剂盒提取)

实验方法原理

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法,碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离,当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
 

简明原理:碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性,再将pH值调至中性使其复性,复性的为质粒DNA,而染色体DNA不会复性,缠结成网状物质,通过离心除去。

实验材料

菌液

试剂、试剂盒

质粒抽提试剂盒RNase ABuffer S1Buffer S2Buffer S3Buffer W1Buffer W2 concentrateEluent

仪器、耗材

DNA 制备管离心管移液枪枪头枪头盒离心机

实验步骤

一、试剂盒组成、贮存、稳定性
 

耗材:DNA 制备管,2 ml 离心管,1.5 ml 离心管。
 

RNase A:50 mg/ml,室温保存。
 

Buffer S1:细菌悬浮液。加入RNase A 后,4°C 贮存。
 

Buffer S2: 细菌裂解液,室温密闭贮存。(若出现沉淀,应于37°C 温浴溶解并冷却至室温后再使用。)
 

Buffer S3:中和液,室温密闭贮存。
 

Buffer W1:洗涤液,室温密闭贮存。
 

Buffer W2 concentrate:去盐液。使用前,根据瓶上数量加入乙醇,混合均匀,室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。
 

Eluent:2.5 mM Tris-HCl,pH 8.5,室温密闭贮存。

 

二、实验准备
 

1.  第一次使用前,RNase A全部加入Buffer S1 中,4°C贮存。
 

2.  准备无核酸和核酸酶污染的Tip头、离心管。
 

3.  第一次使用前,Buffer W2 concentrate中加入指定体积的无水乙醇。
 

三、操作步骤
 

1.  取1-4 ml 在LB 培养基中培养过夜的菌液(若使用丰富培养基,菌液体积应减半或更少),12 000×g 离心1 min,弃尽上清。
 

2.  用250 μl 已加入RNase A 的Buffer S1 悬浮细菌沉淀,悬浮需均匀,不应留有小的菌块。
 

3.  加入250 μl Buffer S2,温和并充分地上下翻转混合4-6 次均匀使菌体充分裂解,直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5 min。
 

4.  加入350 μl Buffer S3,温和并充分地上下翻转混合6-8 次,12 000×g 离心10 min。
 

步骤5~7 可以选择负压法或离心法纯化质粒DNA。
 

A.  负压法

5A.  将质粒DNA 制备管插到负压装置的接口上。吸取步骤4 中的离心上清并转移到制备管中,开启并调节负压至-20-30 英寸汞柱,缓慢吸走管中溶液。
 

6A.  加500 μl Buffer W1,吸尽管中溶液。
 

7A.  加700 μl Buffer W2,吸尽管中溶液;以同样的方法再用700 μl Buffer W2 洗涤一次。
 

* 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
 

B. 离心法
 

5B.  吸取步骤4 中的离心上清并转移到DNA 制备管(置于2 ml 离心管中),12 000×g 离心1 min。
 

6B.  将制备管置回离心管,加500 μl Buffer W1,12 000×g 离心1 min,弃滤液。
 

7B.  将制备管置回离心管,加700 μl Buffer W2,12 000×g 离心1 min, 弃滤液;以同样的方法再用700 μl Buffer W2 洗涤一次。弃滤液。
 

* 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
 

8.  将制备管置回2 ml 离心管中,12 000×g 离心1 min。
 

9.  将制备管移入新的1.5 ml 离心管中,在DNA 制备膜正中央加60-80 μl 水或Eluent,室温静置1 min。12 000×g 离心1 min。

收起 

注意事项

1.  Buffer S2、Buffer S3和Buffer W1含刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套和眼镜,避免沾染皮肤、眼睛和衣服,谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时,要立即用大量清水或生理盐水冲洗,必要时寻求医疗咨询。

2.  本试剂盒为AxyPrep 质粒DNA小量试剂盒,适合于从1-4 ml 细菌培养物中提取多至20 μg 高纯的质粒DNA。

 

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